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酵母雙雜交技術(shù)篩選肝細(xì)胞中與乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白C-12相互作用蛋白的研究

     
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摘要

目的:篩選并克隆人肝細(xì)胞中與 HBcAg 肝細(xì)胞結(jié)合蛋白 C-12新基因相互作用蛋白的基因,進(jìn)一步探討 HBcAg 結(jié)合蛋白 C-12新基因的生物學(xué)功能.方法:用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增 C-12基因,連接入酵母表達(dá)載體 pGBKT7中構(gòu)建誘餌質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109并在其內(nèi)表達(dá),然后與轉(zhuǎn)化了人肝 cDNA 文庫質(zhì)粒pACT2的酵母細(xì)胞 Y187進(jìn)行配合,在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和 X-α-半乳糖(X-α-gal)上進(jìn)行雙重篩選陽性菌落并測序,進(jìn)行生物信息學(xué)分析.結(jié)果:成功克隆出 C-12基因并在酵母細(xì)胞中表達(dá),配合后選出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培養(yǎng)基又能在鋪有X-α-gal 的四缺培養(yǎng)基上生長,并變成藍(lán)色的真陽性菌落21個(gè),其中含金屬硫蛋白 A2基因的菌落有3個(gè)、組織蛋白酶 B 基因1個(gè)、載脂蛋白 M 基因1個(gè)、細(xì)胞色素 C 氧化酶Ⅱ基因3個(gè)、人類受體蛋白酪氨酸激酶變異因子基因1個(gè)、KH 型剪接調(diào)控蛋白基因1個(gè)、磷脂酰肌醇脫酰酶聚糖Q 轉(zhuǎn)錄變異因子1基因1個(gè)、鐵蛋白輕鏈基因2個(gè)、鳥氨酸脫羧酶1基因1個(gè)、血液凝固因子Ⅸ基因1個(gè)、乙酰乳酸合酶基因1個(gè)、鈣激活蛋白酶基因1個(gè)、核外三磷酸鹽雙磷脂酰水解酶5基因1個(gè)、血漿α-球蛋白抑制因子 H4基因1個(gè)和未知蛋白基因2個(gè).結(jié)論:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白 C-12新基因相互作用蛋白的編碼基因,為進(jìn)一步研究 HBcAg 在病毒裝配、損害肝細(xì)胞、感染致病等方面的具體作用提供 (?)新線索.

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