技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種棘胸蛙的DNA分子遺傳標(biāo)記及其用途。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，SSR)是由1-6個(gè)核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列相對(duì)保守，根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，可用PCR擴(kuò)增出微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列。由于微衛(wèi)星中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同，因而擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核生物基因組中，而且隨機(jī)分布，具有高度多態(tài)性，選擇上中性，共顯性等特點(diǎn)，是十分有效的遺傳標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域。如用微衛(wèi)星標(biāo)記分析苧麻品種的親緣關(guān)系(Zhou等，2005，Progress?in?Natural?Science，15：137-142)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行豬品種分類的專利申請(qǐng)“適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標(biāo)記”(公開(kāi)號(hào)CN1370834A)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行家蠶分子連鎖遺傳分析的專利申請(qǐng)“家蠶的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用”(公開(kāi)號(hào)CN1970792A)。

棘胸蛙(Paa?spinosa?David)，屬兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科。棘胸蛙個(gè)體大，肉質(zhì)細(xì)嫩潔白，味道鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，素有“百蛙之王”的美稱。由于人為捕殺和自然環(huán)境的惡化，野生棘胸蛙資源遭到嚴(yán)重破壞，開(kāi)展棘胸蛙人工養(yǎng)殖既有助于保護(hù)野生資源，又能滿足市場(chǎng)需求?，F(xiàn)在，棘胸蛙是我國(guó)重要的養(yǎng)殖蛙類之一，但是由于其基礎(chǔ)研究薄弱，要實(shí)現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖還有許多亟待解決的問(wèn)題，其中包括需要一套有效的分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)資源調(diào)查、標(biāo)記輔助育種等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，利用這些分子標(biāo)記能對(duì)棘胸蛙進(jìn)行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，該微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：8這8種序列中的任意一種；所述SEQID?NO：1對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp16，SEQ?ID?NO：2對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp17，SEQ?IDNO：3對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp18，SEQ?ID?NO：4對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp19，SEQ?ID?NO：5對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp20，SEQ?ID?NO：6對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp21，SEQ?ID?NO：7對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp22，SEQ?ID?NO：8對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星編號(hào)為Psp23。

作為本發(fā)明的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的改進(jìn)：棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，

Psp16?????正向：GTATCATTTTGTGTTTTTT

??????????反向：TTTGAATTGTCTTTTGTC

Psp17?????正向：AGTTATGTGGCAGAGAAAC

??????????反向：AAGAGCACAGGAGAGTCA

Psp18?????正向：GCTTATTGTTGGGCTTCA

??????????反向：TCACTGGCATCAGGTCTG

Psp19?????正向：TCACAATCGACGTAATGG

??????????反向：ACACACAGAGGGTCACACT

Psp20?????正向：TTGGCTCATCAACTACCC

??????????反向：AGTCACATAACATACCCCCT

Psp21?????正向：ACTCTCGCCTCAATCC

??????????反向：ATGTAGCTCAGCGTACTG

Psp22?????正向：ATCTTAGGTGCAGCAACTT

??????????反向：TCCCTTGTGTAGTGTTCAGT

Psp23?????正向：TCGACGATTGCCAGAGACC

??????????反向：GCTGGTGGGGAAACTACATTAT。

本發(fā)明還同時(shí)提供了該類棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的用途：用于對(duì)棘胸蛙進(jìn)行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查或輔助育種。

實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，確定了8個(gè)多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記Psp16、Psp17、Psp18、Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，建立棘胸蛙的微衛(wèi)星DNA的技術(shù)體系并利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。因此，本發(fā)明提供了8個(gè)棘胸蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA序列及擴(kuò)增上述8個(gè)棘胸蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和擴(kuò)增方法，8個(gè)棘胸蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)用于棘胸蛙種質(zhì)資源研究，遺傳關(guān)系分析，標(biāo)記輔助選種和標(biāo)記輔助育種，重復(fù)性好，多態(tài)性高，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明涉及的13個(gè)棘胸蛙自然種群的structure聚類圖(K＝3)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、棘胸蛙(CA)_n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建

依次進(jìn)行以下步驟：

1)、用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(廣西龍勝)基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因組DNA，酶切產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。

2)、將堿基互補(bǔ)的寡核苷酸Sau3AI?Oligo?A：5′-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3′和Oligo?B：5′-pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3′(上海生工合成，HPLC級(jí)純化，200pmol/μl)各取10μl輕輕蝸旋混勻，在PCR儀上80℃變性10分鐘，然后在室溫下使寡核普酸鏈緩慢退火復(fù)性約1小時(shí)，加入60μl高純水制備成濃度為25pmol/μl帶有Sau3AI酶切識(shí)別位點(diǎn)的接頭。

3)、將上述步驟1)所得的酶切產(chǎn)物和步驟2)所得的接頭用T₄DNA連接酶連接，將所得的連接液用維特潔公司的清潔試劑盒純化，去除鹽離子、蛋白和多余的接頭片段，溶解于50μl?TE緩沖液中；得連接產(chǎn)物。

4)、用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(CA)₁₅與步驟3)所得的連接產(chǎn)物DNA片段雜交。具體操作為：在總體積100μl雜交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng連接產(chǎn)物和100pmol生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針，并在95℃下變性10min，60℃雜交1小時(shí)。

5)、在步驟4)所得物中加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads?M-280，購(gòu)自Dynal?Biotech公司)，并在室溫放置30分鐘。

6)、在磁力架上吸附磁珠，棄上清。磁珠用400μl洗滌緩沖液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗滌15分鐘，然后在室溫下分別用2×SSC和1×SSC溶液洗滌兩次，并棄上清。

7)、在步驟6)所得物中加入50μl無(wú)菌水，在90℃下保溫10分鐘，小心吸取上清，上清液即為含有(CA)n重復(fù)序列的單鏈DNA片段。以O(shè)ligo?A為引物，以單鏈DNA片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得雙鏈目的片段。

25μlPCR反應(yīng)體系包含：大約100ng單鏈DNA片段，20mm?Tris-HCI(pH8.3)，100mmKCI，3mm?MgCl₂，dNTP各1000μm，3pmol?Oligo?A，0.8units?Taq?polymerase(Shanghaipromega)。

PCR循環(huán)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性3分鐘，接著5個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，然后進(jìn)行另外30個(gè)循環(huán)的92℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸55s，最后于72℃下延伸10分鐘。檢測(cè)PCR產(chǎn)物并使用維特潔公司的純化試劑盒純化，產(chǎn)物溶解于30μl?TE緩沖液中。

8)、將步驟7)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

實(shí)施例2、含微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆的篩選、測(cè)序及微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)

依次進(jìn)行以下步驟：

1)、挑取實(shí)施例1所得的白色菌落并接種到3ml?LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后提取質(zhì)粒。

2)、以質(zhì)粒DNA為模板，采取三引物法(Gardner等，1999，Journal?of?Heredity，90，301-304)篩選含有(CA)n微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆。

3)、將陽(yáng)性克隆測(cè)序，分析是否含有(CA)n重復(fù)序列，以及是否有足夠的側(cè)翼序列用于引物設(shè)計(jì)。

4)、根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩側(cè)的保守序列，用primer?premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度一般在16—22堿基之間，選擇擴(kuò)增的目標(biāo)片段在150-350bp之間。

實(shí)施例3、棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記穩(wěn)定性和多態(tài)性檢測(cè)

用上述實(shí)施例2所得的微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增32個(gè)來(lái)自同一自然種群的棘胸蛙個(gè)體(浙江)，確定了8個(gè)多態(tài)性豐富，適于棘胸蛙遺傳多樣性檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記(表1)。具體操作過(guò)程如下：

1)、用經(jīng)典的酚-氯仿法抽提32個(gè)棘胸蛙個(gè)體的DNA作為模板。

2)、設(shè)計(jì)的引物合成后對(duì)引物正確性和可行性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用溫度梯度PCR擴(kuò)增多個(gè)模板。15μl的PCR反應(yīng)體系中含大約50ng基因組DNA，10mm?Tris-HCI(pH8.3)，50mm?KCI，1.5mm?MgCl₂，dNTP各500μm，1pmol微衛(wèi)星引物，0.5units?Taq?polymerase(Shanghai?promega)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定哪些引物能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定的目的條帶，以及確定最佳退火溫度(見(jiàn)表一)。最終篩選出8個(gè)位點(diǎn)，分別命名為：Psp16、Psp17、Psp18、Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

3)、分別用上述8個(gè)位點(diǎn)的8對(duì)引物(引物序列見(jiàn)表1)擴(kuò)增這若干個(gè)棘胸蛙個(gè)體的DNA。其中任意一條SSR引物的5’端被加上一段沒(méi)有遠(yuǎn)紅外熒光標(biāo)記的M13序列，而另一條IRDye標(biāo)記的M13引物同時(shí)包含在這個(gè)反應(yīng)體系中。按上述步驟2)的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在LI-COR4300s遺傳自動(dòng)分析儀上進(jìn)行基因分型，配合使用內(nèi)置STR分子量標(biāo)準(zhǔn)(STR?Marker，LI-COR?Bioseienee)和軟件SAGA^GT自動(dòng)判讀條帶，輔以人工校正。

4)、使用軟件CERVUS?2.0統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)目，多態(tài)信息含量(PIC)，觀測(cè)雜合度(Observed?heterozygosities，Ho)和期望雜合度(Expected?heterozygosities，He)。哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg?equilibrium，HWE)偏離測(cè)試和位點(diǎn)間的連鎖不平衡檢驗(yàn)(Linkagedisequilibrium，LD)使用GENEPOP軟件version3.4完成，之后輔以連續(xù)的Bonefermni校正。使用MICRO-CHEKER軟件估算每個(gè)位點(diǎn)的無(wú)效等位基因情況。

最終確定了以下8個(gè)棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，分別是：

編號(hào)為Psp16的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

編號(hào)為Psp17的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

編號(hào)為Psp18的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

編號(hào)為Psp19的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；

編號(hào)為Psp20的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示；

編號(hào)為Psp21的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6所示；

編號(hào)為Psp22的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示；

編號(hào)為Psp23的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：8所示。

表1、引物特性表：引物序列，退火溫度，片段大小

實(shí)施例4、棘胸蛙種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

用上述實(shí)施例3所得的8對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增來(lái)自13個(gè)采樣點(diǎn)總共210個(gè)個(gè)體，檢測(cè)其遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)。具體操作過(guò)程如下：

1)、用于種群遺傳分析的棘胸蛙樣本210只。采樣點(diǎn)及其代號(hào)詳見(jiàn)表2。

表2、棘胸蛙樣品信息

?

?

2)、棘胸蛙基因組DNA的提取

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法(Sambrook?and?Fritsch，et.al，1989)，從腿部肌肉提取基因組DNA。

3)、微衛(wèi)星DNA的PCR擴(kuò)增

(1)PCR反應(yīng)體系

大約50ng基因組DNA，10mm?Tris-HCI(pH8.3)，50mm?KCI，1.5mm?MgCl₂，dNTP各500μm，1pmolSTR引物，0.5units?Taq?polymerase(Shanghai?promega)，0.5pmol熒光標(biāo)記M13引物，IRD700或IRD800(LICOR?Bioseienee)。

(2)PCR反應(yīng)程序

PCR循環(huán)條件如下：95℃預(yù)變性3min，接著35個(gè)循環(huán)的95℃變性30s，位點(diǎn)特異性退火溫度(見(jiàn)表一)30s，72℃延伸30s，最后72℃延鏈8min。

(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR產(chǎn)物在LI-COR4300s遺傳自動(dòng)分析儀上進(jìn)行基因分型，配合使用內(nèi)置STR分子量標(biāo)準(zhǔn)(STR?Marker，LI-COR?Bioseienee)和軟件SAGA^GT自動(dòng)判讀條帶，輔以人工校正。

4)、數(shù)據(jù)分析

使用軟件CERVUS2.0(Marshall?et?al.1998)統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)目，多態(tài)信息含量(PIC)，觀測(cè)雜合度(observed?heterozygosities，Ho)和期望雜合度(expeeted?heterozygosities，H_E)。哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg?equilibrium，HWE)偏離測(cè)試和位點(diǎn)間的連鎖不平衡檢驗(yàn)(linkage?disequilibrium，LD)使用GENEPOP軟件version3.4，(Raymond?&?Rousset?2004)完成。用軟件STRUCTURE(Pritchart?et?al.2000)進(jìn)行種群聚類分析，所生成的聚類圖如圖1所示。圖1中：每一條垂線表示一個(gè)個(gè)體，三種顏色分別代表聚類后的一個(gè)分枝，縱坐標(biāo)表示可能的概率。垂線的顏色組成顯示該個(gè)體可能屬于軟件限定某一個(gè)分枝。圖中顯示，基本可以將黃山種群(HS)、金華種群(JH)、麗水種群(LS)、建陽(yáng)種群(JY)聚為一類；平江種群(PJ)、新干種群(XG)、武夷山種群(WY)、井岡山種群(JG)、永福種群(YF)聚為一類；龍勝種群(LH)、陽(yáng)山種群(YS)、屏邊種群(PB)聚為一類；越南種群(VT)聚類與實(shí)際情況不符，可能由于樣本量有限導(dǎo)致的誤差。

5)、結(jié)果如下：

表3、每個(gè)種群的樣本量、平均等位基因數(shù)、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量(PIC)

?

表4、八個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度(H_O)、期望雜合度(H_E)、多態(tài)信息含量(PIC)、等位基因數(shù)(Na)及平均值

?

表5、八個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在13個(gè)種群中的等位基因數(shù)量、種群內(nèi)期望雜合度、各種群多態(tài)信息含量

注：表中的*表示顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。

由上述圖1及表1～3可以看出，由本發(fā)明的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記體現(xiàn)出高度的種群遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果能很好的反映這十三個(gè)種群的實(shí)際狀況。由此可見(jiàn)，本發(fā)明克隆的八個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能很好的用于棘胸蛙種群的遺傳多樣性分析和遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，并用于種質(zhì)資源的調(diào)查和輔助育種。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

SEQ?ID?NO：1

SEQ?ID?NO：2

SEQ?ID?NO：3

SEQ?ID?NO：4

SEQ?ID?NO：5

SEQ?ID?NO：6

SEQ?ID?NO：7

SEQ?ID?NO：8