具體實(shí)施方式

所述用于制備包含芳香族乙烯基化合物-羥基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔樹脂珠的方法包括：在有機(jī)溶劑中溶解單體混合物和聚合引發(fā)劑以獲得所述單體混合物和所述聚合引發(fā)劑的溶液，所述單體混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物；在分散穩(wěn)定劑的存在下在水中懸浮所述溶液；進(jìn)行懸浮共聚，從而獲得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物；以及水解所得共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基基團(tuán)。

在本發(fā)明中，芳香族乙烯基化合物的實(shí)例包括但并不限于苯乙烯，環(huán)核被烷基取代的苯乙烯，諸如鄰-甲基苯乙烯、間-甲基苯乙烯、對(duì)-甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯以及對(duì)-叔丁基苯乙烯，α位被烷基取代的苯乙烯，諸如α-甲基苯乙烯和α-甲基-對(duì)-甲基苯乙烯，以及核環(huán)被鹵代的苯乙烯，諸如氯代苯乙烯。根據(jù)本發(fā)明，其中優(yōu)選使用苯乙烯作為芳香族乙烯基化合物。

在本發(fā)明中，除了酰氧基基團(tuán)之外，酰氧基苯乙烯可具有在芳香核上的一個(gè)或多個(gè)任意的取代基，只要其不會(huì)對(duì)懸浮共聚產(chǎn)生不利的影響或者當(dāng)所得多孔珠用作固相合成用載體時(shí)不會(huì)引起有害的作用即可。這類取代基的實(shí)例包括碳數(shù)為1～5的烷基或烷氧基、鹵素原子和硝基。

在本發(fā)明中，酰氧基苯乙烯的芳香核上酰氧基相對(duì)于乙烯基的位置并沒(méi)有特別的限制，但是優(yōu)選為對(duì)位。即，在本發(fā)明中酰氧基苯乙烯優(yōu)選為對(duì)-酰氧基苯乙烯。此外，?；械耐榛鶅?yōu)選碳數(shù)為1～5。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選對(duì)-乙酰氧基苯乙烯作為酰氧基苯乙烯。

在本發(fā)明中，二(甲基)丙烯酸酯化合物指二甲基丙烯酸酯或二丙烯酸酯，并且優(yōu)選為選自二(甲基)丙烯酸(聚)乙二醇酯和二(甲基)丙烯酸烷二醇酯中的至少一種。

所述二(甲基)丙烯酸(聚)乙二醇酯的具體實(shí)例包括二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸四乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三丙二醇酯、以及二(甲基)丙烯酸聚丙二醇酯。

在本發(fā)明中，二(甲基)丙烯酸烷二醇酯中的烷優(yōu)選碳數(shù)為4～10。因此，二(甲基)丙烯酸烷二醇酯的具體實(shí)例包括二(甲基)丙烯酸1，2-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，3-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，4-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，5-戊二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，6-己二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，9-壬二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，10-癸二醇酯、二(甲基)丙烯酸2-甲基-1，8-辛二醇酯、以及二(甲基)丙烯酸1，4-環(huán)己二醇酯。

根據(jù)本發(fā)明，在芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物的單體混合物中，該單體混合物用于所述懸浮共聚，酰氧基苯乙烯優(yōu)選以80～800μmol/g的比例，并且更優(yōu)選以200～500μmol/g的比例被包含。如果酰氧基苯乙烯在所述單體混合物中的比例小于80μmol/g，則獲得的多孔樹脂珠中羥基的量低，并且當(dāng)該多孔樹脂珠用作固相合成用載體時(shí)，獲得的合成反應(yīng)產(chǎn)物的量少。另一方面，如果酰氧基苯乙烯在所述單體混合物中的比例超過(guò)800μmol/g，由于在獲得的多孔樹脂珠中羥基密度高，所以在所述載體上相互鄰近發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)相互抑制，導(dǎo)致獲得的合成反應(yīng)產(chǎn)物的純度降低。

在所述單體混合物中，二(甲基)丙烯酸酯化合物的比例優(yōu)選為200～2,000μmol/g，并且更優(yōu)選為300～1,500μmol/g。如果二(甲基)丙烯酸酯化合物在所述單體混合物中的比例小于200μmol/g，則獲得的多孔樹脂珠的比表面積過(guò)小，并且當(dāng)該多孔樹脂珠用作固相合成用載體時(shí)，獲得的合成反應(yīng)產(chǎn)物的量少。另一方面，如果二(甲基)丙烯酸酯化合物在所述單體混合物中的比例超過(guò)2,000μmol/g，由于獲得的多孔樹脂珠在有機(jī)溶劑中的溶脹度低，所以獲得的合成反應(yīng)產(chǎn)物的量少。

在本發(fā)明中，包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物的單體混合物的懸浮共聚可通過(guò)常規(guī)已知的普通方法進(jìn)行。例如，將所述單體混合物和聚合引發(fā)劑溶解在有機(jī)溶劑中，將分散穩(wěn)定劑單獨(dú)溶解在水中，在氮?dú)饬髦谢旌线@兩種溶液，攪拌該混合溶液使得通過(guò)將所述單體混合物和聚合引發(fā)劑溶解在有機(jī)溶劑中而獲得的溶液可作為小液滴被分散在水中，并且通過(guò)升高溫度在攪拌下進(jìn)行所述聚合反應(yīng)。所述懸浮共聚反應(yīng)可通常于60～90℃的反應(yīng)溫度在攪拌下進(jìn)行0.5～48小時(shí)，但共聚的反應(yīng)條件并不僅限于此。

在本發(fā)明中，選自烴和醇的至少一種作為有機(jī)溶劑。在本發(fā)明中，烴包括脂肪烴和芳香烴，并且脂肪烴可以是飽和或不飽和的，但優(yōu)選烷基苯或碳數(shù)為5～12的飽和脂肪烴。碳數(shù)為5～12的脂肪族飽和烴的實(shí)例包括正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、十一烷以及十二烷。所述烷基苯的實(shí)例包括甲苯。

另一方面，醇優(yōu)選為脂族醇，更優(yōu)選碳數(shù)為5～12脂族醇。其具體優(yōu)選的實(shí)例包括2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇以及環(huán)己醇。在本發(fā)明中，這些烴和醇的一種可單獨(dú)使用，或者烴和醇可組合使用。

在本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑通常以0.5～2.5、優(yōu)選以1.0～2.0的有機(jī)溶劑/單體的重量比被使用。如果有機(jī)溶劑/單體的重量比小于或超過(guò)上述的范圍，在這兩種情況下，獲得的多孔樹脂珠的比表面積都會(huì)變小，并且例如當(dāng)該多孔樹脂珠用作固相合成用載體時(shí)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)的合成反應(yīng)產(chǎn)物的量減少。

分散穩(wěn)定劑沒(méi)有特別限制，并且可使用任意的分散穩(wěn)定劑，只要其在懸浮共聚中通常用作分散穩(wěn)定劑即可。分散穩(wěn)定劑的實(shí)例包括親水性保護(hù)膠體劑，諸如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明膠、淀粉和羧甲基纖維素；以及難溶解的無(wú)機(jī)粉末，諸如碳酸鈣、碳酸鎂、磷酸鈣、硫酸鋇、硫酸鈣和膨潤(rùn)土。雖然沒(méi)有特別限制，但基于在懸浮共聚中使用的水，分散穩(wěn)定劑的用量?jī)?yōu)選為0.01～10重量％。基于在懸浮共聚中使用的水，如果分散穩(wěn)定劑的用量小于0.01重量％，則懸浮共聚的穩(wěn)定性被削弱并且產(chǎn)生大量聚集。另一方面，基于在懸浮共聚中使用的水，如果分散穩(wěn)定劑的量超過(guò)10重量％，則產(chǎn)生大量過(guò)于細(xì)小以致不能作為固相合成用載體的粒子。

此外，對(duì)于用在懸浮共聚中的聚合引發(fā)劑沒(méi)有特別限制，并且可使用任意的聚合引發(fā)劑，只要其在懸浮共聚中通常用作聚合引發(fā)劑即可。所述聚合引發(fā)劑的實(shí)例包括過(guò)氧化物，例如過(guò)氧化苯甲酰、過(guò)氧化月桂酰、過(guò)氧化硬脂酰、1，1-二(叔丁基過(guò)氧)-2-甲基環(huán)己烷、1，1-二(叔己基過(guò)氧)-3，3，5-三甲基環(huán)己烷、1，1-二(叔己基過(guò)氧)環(huán)己烷、1，1-二(叔丁基過(guò)氧)環(huán)己烷、二叔己基過(guò)氧化物、叔丁基枯基過(guò)氧化物、二叔丁基過(guò)氧化物、過(guò)氧化(2-乙基己酸)1，1，3，3-四甲基丁酯、過(guò)氧化(2-乙基己酸)叔己酯、過(guò)氧化(2-乙基己酸)叔丁酯以及單碳酸叔丁基過(guò)氧異丙酯；以及偶氮化合物，例如2，2-偶氮二異丁腈、2，2′-偶氮二-2-甲基丁腈和2，2′-偶氮二-2，4-二甲基戊腈。

如上所述，將其中溶解了單體混合物和聚合引發(fā)劑的有機(jī)溶劑懸浮在水中，并且進(jìn)行懸浮共聚以使共聚物沉淀。其后，通過(guò)洗滌凈化所述共聚物，以除去殘留在該共聚物中的單體和諸如有機(jī)溶劑、分散穩(wěn)定劑以及聚合引發(fā)劑的雜質(zhì)。對(duì)于洗滌用溶劑沒(méi)有特別限制，只要其為對(duì)除去那些雜質(zhì)有用的溶劑即可，但通常使用水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲苯、己烷、四氫呋喃等。對(duì)于洗滌所得的共聚物，可通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)：例如，在懸浮共聚后吸濾所述共聚物的液態(tài)分散體，在洗滌用溶劑中用攪拌洗滌所得共聚物，并且以同樣的方式重復(fù)對(duì)所述共聚物的吸濾和隨后的洗滌操作。在該洗滌過(guò)程中，如果需要，可加熱該體系以除去所述共聚物中的揮發(fā)性雜質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明，首先以這種方式獲得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物，并且然后水解所述共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基基團(tuán)，由此可獲得目標(biāo)多孔樹脂珠，所述珠包含芳香族乙烯基化合物-羥基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物。

對(duì)于水解芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基基團(tuán)，可采用常規(guī)已知的方法和條件。然而，在本發(fā)明中，不需要水解所得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中的所有酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基團(tuán)，并且即使部分酰氧基被水解通常也是充分的。

在本發(fā)明中，用于水解芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基的催化劑可以是酸性催化劑，諸如鹽酸和氫溴酸；或堿性催化劑，諸如肼、氫氧化鈉、四甲基氫氧化銨以及氨水。用于水解的反應(yīng)溶劑的優(yōu)選實(shí)例包括但并不限于四氫呋喃、乙醇、甲醇、二氧六環(huán)和水。

在本發(fā)明中，可適當(dāng)?shù)卦O(shè)置水解的反應(yīng)條件。例如，在使用含乙醇的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行水解的情況下，氫氧化鈉的使用量為芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的1～10當(dāng)量，乙醇的使用量為水使用重量的1～10倍，并且該反應(yīng)在50～80℃下進(jìn)行1～12小時(shí)。優(yōu)選地，氫氧化鈉的使用量為酰氧基苯乙烯單體組分的1～5當(dāng)量，并且該反應(yīng)在50～80℃下進(jìn)行1～6小時(shí)。如果氫氧化鈉的使用量過(guò)大或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則得自二(甲基)丙烯酸酯的酯水解并且多孔樹脂珠耐溶劑性受到損害。通過(guò)使用酸或堿將水解后的反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)至接近中性，并且接著以與上述同樣的方法洗滌以除去雜質(zhì)。

如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)懸浮共聚單體混合物而獲得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物，所述單體混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物，以及可通過(guò)水解所得共聚物中酰氧基苯乙烯單體組分的酰氧基而制備包含芳香族乙烯基化合物-羥基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物的多孔樹脂珠。此后，如果需要的話，可對(duì)多孔樹脂珠進(jìn)一步進(jìn)行諸如干燥或分級(jí)的處理。

由此獲得的多孔樹脂珠可被適當(dāng)?shù)赜米鞴滔嗪铣捎幂d體以合成例如寡核苷酸。附帶地講，使用根據(jù)本發(fā)明的多孔樹脂珠作為固相合成用載體合成寡核苷酸可通過(guò)傳統(tǒng)已知的方法進(jìn)行。例如，連接劑被鍵合到本發(fā)明多孔樹脂珠的羥基上，然后亞酰胺(amidite)單元被逐一鍵合從而得到從該連接劑末端開始的預(yù)定的堿基序列?？墒褂米詣?dòng)合成裝置進(jìn)行該合成反應(yīng)。例如，將鍵合連接劑的多孔樹脂珠填充在所述裝置的流式反應(yīng)器中，依次向其中填充各種有機(jī)溶劑例如乙腈和亞酰胺溶液，并且重復(fù)該反應(yīng)。最后，所述連接劑部分由于水解等而斷開，從而獲得目標(biāo)寡核苷酸。對(duì)于所述連接劑，可適當(dāng)?shù)厥褂贸Ｒ?guī)已知的連接劑。例如，寡核苷酸可通過(guò)將具有如下所示結(jié)構(gòu)的核苷連接劑與本發(fā)明的多孔樹脂珠鍵合而合成。

在本文上述結(jié)構(gòu)式中，圓代表包含芳香族乙烯基化合物-羥基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔樹脂珠，其可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得，DMT代表在5′-位的保護(hù)性二甲氧基三苯甲基，以及B₁代表堿基。

實(shí)施例

在下面通過(guò)參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

(懸浮共聚)

將配備有冷凝器、攪拌器和氮?dú)馊肟诠艿娜莘e為500mL的可拆式燒瓶浸在恒溫水浴中，并且將2.5g聚乙烯醇和250g蒸餾水加入到其中并在300rpm下攪拌溶解，以制備聚乙烯醇水溶液。

單獨(dú)地，將50g?of苯乙烯、3.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：369μmol/g)、5g二甲基丙烯酸乙二醇酯(在單體混合物中比例：431μmol/g)、85g的2-乙基己醇、25g異辛烷以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)混合以制備溶液。將該溶液加入到上述制備的聚乙烯醇水溶液中，并且于室溫下在氮?dú)饬髦幸?00rpm的攪拌速率攪拌后懸浮在水中，通過(guò)將溫度升高至80℃進(jìn)行懸浮共聚8小時(shí)。

(洗滌)

使用蒸餾水和丙酮通過(guò)過(guò)濾洗滌所得共聚物，并且然后將其分散到丙酮中使總量為約1L。

(分級(jí))

然后放置由此獲得的液態(tài)分散體直到珠狀共聚物沉淀，使得即使當(dāng)容器傾斜時(shí)，容器底部的沉淀物也不會(huì)受干擾，并且然后除去浮在上層的丙酮。再次將丙酮加到容器中使總量為約500mL，使所述液態(tài)分散體靜置，并且然后將丙酮的除去重復(fù)10次以上，由此進(jìn)行所述分級(jí)。過(guò)濾由此獲得的液態(tài)分散體，并且在減壓下干燥殘留物以獲得由苯乙烯-對(duì)乙酰氧基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠。

(水解)

將配備有冷凝器、攪拌器和氮?dú)馊肟诠艿娜莘e為500mL的可拆式燒瓶浸在恒溫水浴中，并且將20g由苯乙烯-對(duì)乙酰氧基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物組成的上述粉末狀多孔樹脂珠，以及100g乙醇加到其中并在攪拌下分散。隨后，加入通過(guò)將1g氫氧化鈉溶解在50g蒸餾水中而制備的水溶液，然后通過(guò)升高溫度至75℃而進(jìn)行水解反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完成后，用鹽酸中和所得反應(yīng)混合物并且使用蒸餾水和丙酮通過(guò)過(guò)濾而洗滌。最后，過(guò)濾所獲得的液態(tài)分散體并且在減壓下進(jìn)一步干燥，以獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠。

(分析)

對(duì)所獲得的多孔樹脂珠進(jìn)行以下分析。

(1)中值粒徑

中值粒徑用激光衍射/散射法測(cè)量(激光衍射/散射粒度分布分析儀，LA-920，由Horiba有限公司制造)。

(2)平均孔徑

平均孔徑用壓汞法測(cè)量(壓汞儀，PoreMaster60GT，由Quantachrome?Instruments(康塔儀器公司)制造)。

(3)羥基的量

羥基的量通過(guò)根據(jù)JIS?K?0070的滴定法測(cè)量。即，待被測(cè)量的多孔樹脂珠的羥基用已知量的乙?；噭?乙酸酐/吡啶)乙?；?，以及通過(guò)使用氫氧化鉀滴定測(cè)量在該乙?；袥](méi)被消耗的乙酸酐的量，由此計(jì)算在所述樣品中羥基的量。更具體地，如下所述進(jìn)行該步驟。

通過(guò)將吡啶加到25g乙酸酐中使總量為100mL而制備所述乙酰化試劑，將0.5～2g測(cè)量樣品(干燥的多孔樹脂珠)放在燒瓶中稱重，并且將0.5mL乙?；噭┖?.5mL吡啶全部加入燒瓶中。將燒瓶中的混合物在95～100℃下保持2小時(shí)，然后冷卻到室溫，并且向其中加入1mL蒸餾水。加熱10分鐘后，在乙?；饔弥袥](méi)被消耗的乙酸酐分解。將燒瓶中的全部?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到燒杯中，用蒸餾水稀釋到總量為150mL，然后用0.5N的氫氧化鈉水溶液滴定。

單獨(dú)地，用與上述相同的操作測(cè)量未加入測(cè)量樣品的空白值。根據(jù)下列公式(1)計(jì)算所述測(cè)量樣品中羥基的量，其中A(μmol/g)為所述測(cè)量樣品中羥基的量，B(mL)為測(cè)量空白時(shí)氫氧化鉀水溶液的滴定度，C(mL)為測(cè)量所述測(cè)量樣品時(shí)氫氧化鉀水溶液的滴定度，f為氫氧化鉀水溶液的系數(shù)，以及M(g)為所述測(cè)量樣品的重量。

A＝(B-C)×0.5(mol/L)×f×1000÷M??(1)

所述多孔樹脂珠的中值粒徑為80μm、平均孔徑為29nm、以及羥基的量為491μmol/g。

實(shí)施例2

(多孔樹脂珠的制備)

以與實(shí)施例1中相同的方式獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二甲基丙烯酸三乙二醇酯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠，與實(shí)施例1中不同的是使用40g苯乙烯、3.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：369μmol/g)、15g二甲基丙烯酸三乙二醇酯(在單體混合物中的比例：897μmol/g)、80g1-十一烷醇以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)。

以與實(shí)施例1中相同的方式分析獲得的多孔樹脂珠，結(jié)果，中值粒徑為75μm、平均孔徑為34nm、以及羥基的量為393μmol/g。

(核苷連接劑與多孔樹脂珠的鍵合)

將上述獲得的多孔樹脂珠(1g)、0.18g的DMT-dT-3′-琥珀酸鹽(由Beijing?OM?Chemicals(北京歐艾姆化工有限公司)制備)、0.09g的HBTU(由Novabiochem制備)、0.084mL的N，N-二異丙基乙基胺以及10mL乙腈混合并且于室溫中在攪拌下反應(yīng)12小時(shí)，以及通過(guò)使用乙腈過(guò)濾來(lái)洗滌反應(yīng)混合物并干燥。另外，將2.5mL的CapA(20％乙酸酐/80％乙腈)、2.5mL的CapB(20％N-甲基咪唑/30％吡啶/50％乙腈)、0.025g的4-二甲基氨基吡啶以及5mL乙腈混合并且于室溫中在攪拌下反應(yīng)12小時(shí)，以及在減壓下通過(guò)使用乙腈過(guò)濾來(lái)洗滌反應(yīng)混合物并且然后干燥，從而獲得DMT-dT-3′-琥珀酸鹽鍵合的多孔樹脂珠。通過(guò)測(cè)量DMT基團(tuán)的吸光率(412nm)而測(cè)定的DMT-dT-3′-琥珀酸鹽的加入量在表1中示出，所述DMT基團(tuán)用對(duì)-甲苯璜酸/乙腈脫保護(hù)。

(寡核苷酸的合成)

將上述獲得的DMT-dT-3′-琥珀酸鹽鍵合的多孔樹脂珠填充在柱中，將該柱固定在Applied?Biosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)3400DNA合成器(由Applied?Biosystems制造)中，并且在合成規(guī)模為1μmol和DMT截去的條件下合成寡核苷酸dT20。將合成后的柱干燥，以及通過(guò)重量測(cè)量測(cè)定所得寡核苷酸的重量產(chǎn)率(mg/μmol)在表1中示出。

通過(guò)將使用濃氨水的反應(yīng)在55℃下進(jìn)行12小時(shí)，寡核苷酸從所述多孔樹脂珠裂解和脫保護(hù)。通過(guò)紫外線吸光率測(cè)量法(260nm)測(cè)量所獲得寡核苷酸的OD產(chǎn)率在表1中示出。

通過(guò)HPLC測(cè)量法(由Waters?Corp.(沃特世有限公司)制造的Alliance?UV?System，由YMC制造的Hydrosphere?C18)測(cè)定的所得核苷酸中dT20(全長(zhǎng))的比例在表1中示出。

實(shí)施例3

(多孔樹脂珠的制備)

以與實(shí)施例1中相同的方式獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠，與實(shí)施例1中不同的是使用40g苯乙烯、3.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：369μmol/g)、15g的二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯(在單體混合物中比例：1,008μmol/g)、75g的1-癸醇以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)。

以與實(shí)施例1中相同的方式分析獲得的多孔樹脂珠，結(jié)果，中值粒徑為72μm、平均孔徑為26nm、以及羥基的量為446μmol/g。

實(shí)施例4

(多孔樹脂珠的制備)

以與實(shí)施例1中相同的方式獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二丙烯酸1，9-壬二醇酯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠，與實(shí)施例1中不同的是使用48g苯乙烯、2.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：264μmol/g)、8g二丙烯酸1，9-壬二醇酯(在單體混合物中的比例：510μmol/g)、90g1-壬醇以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)。

(核苷連結(jié)基和多孔樹脂珠的鍵合以及寡核苷酸的合成)

以與實(shí)施例2中相同的方法進(jìn)行DMT-dT-3′-琥珀酸鹽鍵合的多孔樹脂珠的制備與寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸鹽的鍵合量、寡核苷酸的重量產(chǎn)率、寡核苷酸的OD產(chǎn)率、以及dT20(全長(zhǎng))的比例均在表1中示出。

對(duì)比例1

(多孔樹脂珠的制備)

以與實(shí)施例1中相同的方式獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠，與實(shí)施例1中不同的是使用48g苯乙烯、3.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：369μmol/g)、7g二乙烯基苯(55％)(在單體混合物中的比例：506μmol/g)、52g2-乙基己醇、23g異辛烷以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)。

以與實(shí)施例1中相同的方式分析獲得的多孔樹脂珠，結(jié)果，中值粒徑為86μm、平均孔徑為33nm、以及羥基的量為422μmol/g。

(核苷連結(jié)劑與多孔樹脂珠的鍵合以及寡核苷酸的合成)

以與實(shí)施例2中相同的方法進(jìn)行DMT-dT-3′-琥珀酸鹽鍵合的多孔樹脂珠的制備與寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸鹽的鍵合量、寡核苷酸的重量產(chǎn)率、寡核苷酸的OD產(chǎn)率、以及dT20(全長(zhǎng))的比例均在表1中示出。

對(duì)比例2

(多孔樹脂珠的制備)

以與實(shí)施例1中相同的方式獲得由苯乙烯-對(duì)羥基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物組成的粉末狀多孔樹脂珠，與實(shí)施例1中不同的是使用48g苯乙烯、3.5g對(duì)-乙酰氧基苯乙烯(在單體混合物中的比例：369μmol/g)、7g二乙烯基苯(55％)(在單體混合物中的比例：506μmol/g)、75g的1-癸醇以及1g過(guò)氧化苯甲酰(25％含水的產(chǎn)品)。

以與實(shí)施例1中相同的方式分析獲得的多孔樹脂珠，結(jié)果，中值粒徑為116μm、平均孔徑為68nm、以及羥基的量為432μmol/g。

(核苷連結(jié)劑與多孔樹脂珠的鍵合以及寡核苷酸的合成)

以與實(shí)施例2中相同的方法進(jìn)行DMT-dT-3′-琥珀酸鹽鍵合的多孔樹脂珠的制備與寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸鹽的鍵合量、寡核苷酸的重量產(chǎn)率、寡核苷酸的OD產(chǎn)率、以及dT20(全長(zhǎng))的比例均在表1中示出。

表1

?

表1中的結(jié)果表明，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2～4的多孔樹脂珠時(shí)，與對(duì)比例1和2的多孔樹脂珠相比，可增加寡核苷酸的合成產(chǎn)率，同時(shí)維持高的全長(zhǎng)百分比。

雖然已結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但對(duì)本發(fā)明的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離其范圍的前提下對(duì)其進(jìn)行各種改變和修改是顯然的。

本申請(qǐng)是基于2007年11月5日提交的日本專利申請(qǐng)No.2007-286835，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。

此外，本文引用的所有參考文獻(xiàn)也全部并入。