摘要： 為探討2-甲氧雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME2)、胰島素樣生長因子-1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1)、堿性成纖維生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)對體細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,以牛(Bos taurus)耳皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象,進(jìn)行流式細(xì)胞分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,1μmol/L 2-ME2可顯著提高細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞及G1早期(early G1,eG1)細(xì)胞所占比例,20 ng/mL IGF-1、10 ng/mL bFGF、ITS及4種細(xì)胞因子聯(lián)合處理對細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞和G1早期細(xì)胞所占比例無顯著影響,表明2-ME2能夠顯著影響牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期,研究結(jié)果對體細(xì)胞核移植技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)獲得更多G0/G1期和eG1期的供體細(xì)胞具有重要意義。

摘要： 肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)是一種骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,可以抑制成肌細(xì)胞的增殖,是動(dòng)物品種改良的重要候選基因,該基因突變能夠引起骨骼肌的廣泛性增生與肥大,產(chǎn)生“雙肌”癥狀,導(dǎo)致動(dòng)物脂肪分化減少、肌肉含量增加,從而滿足市場動(dòng)物肉品質(zhì)消費(fèi)的需求。為了獲得“雙肌”表型的MSTN基因突變克隆山羊,本研究在山羊MSTN基因第一外顯子序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建TALENs表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得抗性細(xì)胞株,通過PCR檢測和基因測序篩選MSTN基因突變細(xì)胞株作為供核細(xì)胞進(jìn)行山羊體細(xì)胞核移植,并鑒定MSTN基因突變類型;通過組織切片分析MSTN基因突變山羊肌肉組織形態(tài)結(jié)構(gòu),監(jiān)測不同月齡克隆山羊體重并分析其不同生長發(fā)育階段的體重增長趨勢。結(jié)果表明,共獲得109株MSTN基因突變細(xì)胞株,突變效率達(dá)到79.0%(109/138),其中46株為雙等位基因突變,占細(xì)胞株總數(shù)的33.3%(46/138)。選取4株生長狀態(tài)較好的MSTN基因突變細(xì)胞株(1株為雙等位基因純合突變,3株為非純合突變)進(jìn)行體細(xì)胞核移植至12只受體山羊,30 d時(shí)B超檢查出受孕母羊4只,受孕率為33.3%(4/12),妊娠到期分娩2只克隆山羊,測序結(jié)果表明M-1克隆山羊MSTN雙等位基因中的一個(gè)等位基因未產(chǎn)生突變,另一個(gè)等位基因缺失3 bp;M-2克隆山羊MSTN雙等位基因中的一個(gè)等位基因產(chǎn)生1 bp堿基插入,另一個(gè)等位基因缺失13 bp,兩種突變均造成MSTN在突變位點(diǎn)之后的蛋白序列丟失。此外,M-1克隆山羊肌纖維排列緊密且粗大,每月體重均高于普通野生型山羊,但與普通野生型山羊生長趨勢一致,且能夠健康發(fā)育至成年。本研究利用TALENs技術(shù)成功介導(dǎo)山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾,并獲得MSTN基因突變的山羊胎兒成纖維細(xì)胞,將其作為供核細(xì)胞成功生產(chǎn)MSTN基因突變克隆山羊,為培育“雙肌”表型山羊新品系奠定了技術(shù)基礎(chǔ),也為將來其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備提供了參考方法。

摘要： 體細(xì)胞核移植(somaticcell nucleartransfer,SCNT)是一種將已分化的細(xì)胞重編程恢復(fù)其全能性,進(jìn)而生產(chǎn)與供體細(xì)胞基因型完全相同后代的無性繁殖技術(shù)。包括收集并成熟卵母細(xì)胞,供體細(xì)胞核處理,重構(gòu)胚的體外激活,胚胎的培養(yǎng)和移植等過程。豬的SCNT技術(shù)的建立在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)有廣泛的應(yīng)用。

摘要： 體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一種能將已分化的體細(xì)胞重編程為全能胚胎的繁殖生物技術(shù),在良種擴(kuò)繁、瀕危物種保護(hù)和治療性克隆等方面有著廣泛的應(yīng)用前景,但極低的克隆效率、克隆動(dòng)物胎盤異常、出生后胎兒畸形等嚴(yán)重限制了該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。造成克隆效率低和胚胎發(fā)育異常的主要原因是供體核表觀遺傳重編程錯(cuò)誤或不完全。1958年,將非洲爪蟾(Xenopus laevis)幼體腸細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞,獲得了第1例SCNT動(dòng)物個(gè)體;1986年,通過電融合1個(gè)卵裂球與去核卵母細(xì)胞成功獲得了3只存活的羔羊;1997年,將成年母羊的乳腺上皮細(xì)胞與去核卵細(xì)胞電融合,獲得首個(gè)SCNT哺乳動(dòng)物“多利”,開啟了克隆時(shí)代,目前牛、小鼠、山羊、豬、歐洲盤羊、家兔、家貓、馬、大鼠、騾子、狗、雪貂、狼、水牛、紅鹿、單峰駱駝、食蟹猴等相繼成功克隆,其中最引人矚目的是2018年食蟹猴的成功克隆。作者通過將SCNT胚胎與受精胚胎的發(fā)育進(jìn)行對比,闡述了SCNT過程中DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印跡、染色體狀態(tài)等的重編程過程和缺陷,并從表觀修飾劑、組蛋白去甲基化酶、抑制Xist表達(dá)、補(bǔ)充魚精蛋白和精子RNA方面探討單獨(dú)或聯(lián)合消除表觀遺傳重編程障礙對克隆效率的影響。隨著低樣本量測序技術(shù)的發(fā)展和完善,人們能夠在SCNT胚胎中檢測到更詳細(xì)的全基因組表觀遺傳修飾圖譜,進(jìn)一步揭示SCNT胚胎表觀遺傳重編程中的缺陷,為提高克隆效率提供了線索。通過上述內(nèi)容的闡述,希望為后續(xù)開發(fā)聯(lián)合消除多種表觀遺傳障礙而提高克隆效率的策略和思路。

摘要： 豬的胚胎發(fā)育需要經(jīng)歷受精、卵裂、孵化、形態(tài)轉(zhuǎn)變、附植、器官分化等一系列重要的生理階段。雖然在胚胎發(fā)育過程中基因的嚴(yán)格表達(dá)與正確指導(dǎo)是胚胎能否正常發(fā)育的決定性條件,但研究表明DNA甲基化修飾對胚胎的發(fā)育也起著必不可少的作用。DNA甲基化是一種常見且重要的表觀遺傳修飾,雖然不改變DNA的一級(jí)序列,但也包含可遺傳信息,并在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。在豬的胚胎發(fā)育中,DNA甲基化呈現(xiàn)出高度動(dòng)態(tài)的過程,這一過程受孕期母體營養(yǎng)和發(fā)育環(huán)境條件影響。本文將從胚胎早期發(fā)育、體細(xì)胞核移植和孕期母體營養(yǎng)三個(gè)方面來闡述DNA甲基化對胚胎發(fā)育的影響,為進(jìn)一步研究豬胚胎在發(fā)育過程中的DNA甲基化機(jī)制和提高體細(xì)胞核移植的成功率提供參考。

摘要： 活體采卵(ovum pick-up,OPU)是一種使用非手術(shù)方法從供體母牛中獲得卵母細(xì)胞的方法,能夠在對供體損傷較小的情況下獲得較多的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞,現(xiàn)已在各繁殖育種技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用,但活體采卵仍存在效率較為低下、影響因素多、操作技術(shù)及設(shè)備要求較高等問題。論文介紹了牛活體采卵發(fā)展歷史,并對活體采卵的3種方法(盲采法、內(nèi)窺鏡法和超聲波法)的操作及研究進(jìn)展和活體采卵的影響因素進(jìn)行了綜述,最后分析了活體采卵在體外胚胎生產(chǎn)和體細(xì)胞核移植等技術(shù)的應(yīng)用前景,旨在為活體采卵技術(shù)發(fā)展完善及在繁殖育種中的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供參考。

摘要： [目的]體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)在農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但是克隆效率太低制約了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣.本研究的目的在于探究印記基因XIST和H19 DNA甲基化水平與克隆效率的聯(lián)系.[方法]利用同一頭豬源耳朵成纖維細(xì)胞培養(yǎng)獲得14個(gè)細(xì)胞克隆團(tuán),分別作為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)比較以各克隆團(tuán)為供體細(xì)胞生產(chǎn)克隆胚胎的囊胚率以及各囊胚的XIST和H19基因調(diào)控區(qū)的DNA甲基化水平,對XIST和H19基因差異甲基化區(qū)域DNA甲基化水平與克隆胚胎的囊胚率進(jìn)行相關(guān)性分析.[結(jié)果]以1號(hào)克隆團(tuán)為供體細(xì)胞得到囊胚的XIST基因DNA甲基化水平最高且囊胚率最低,分別為65.04％、8.6％,以14號(hào)克隆團(tuán)為供體細(xì)胞得到XIST基因囊胚的DNA甲基化水平最低但囊胚率最高,分別為16.68％、38.2％;相關(guān)性分析表明XIST基因的DNA甲基化水平與囊胚率之間存在高度負(fù)相關(guān)(|r|=0.8125>0.8).H19基因A側(cè)甲基化平均水平最高和最低分別為5.12％和0.61％,相關(guān)性分析表明H19基因A側(cè)DNA甲基化水平與囊胚率間只有極弱的相關(guān)(|r|=0.1647<0.3);H19基因G側(cè)DNA甲基化水平最高和最低分別為90.92％和72.69％,相關(guān)性分析表明H19基因G側(cè)DNA甲基化水平與囊胚率間只有低度相關(guān)(0.3<|r|=0.3098<0.5).[結(jié)論]XIST基因DNA甲基化水平越低,則克隆團(tuán)囊胚率越高.研究結(jié)果對提高豬SCNT胚胎發(fā)育效率,改善現(xiàn)有的豬SCNT技術(shù)體系提供了基礎(chǔ).

摘要： [目的]建立快速篩選豬的基因編輯陽性成纖維細(xì)胞系的方法以提高利用體細(xì)胞核移植產(chǎn)生基因編輯克隆豬的效率.[方法]通過PCR、T7EN1酶切和Sanger測序分析不同數(shù)量的已知豬基因編輯陽性細(xì)胞(20、50、100、150和200個(gè)細(xì)胞)的基因型,確定最小細(xì)胞數(shù)用于鑒定未知的基因編輯陽性細(xì)胞系以證明該方法的可行性.[結(jié)果]除20細(xì)胞組外,其他所有細(xì)胞組中均擴(kuò)增出2條明顯的T7EN1酶切條帶(175和555 bp).定量數(shù)據(jù)顯示:20細(xì)胞組和50細(xì)胞組之間的條帶灰度值存在極顯著差異(P＜0.01),因此50細(xì)胞可用于基因編輯陽性細(xì)胞系鑒定.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建IPO13打靶載體,轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞形成細(xì)胞克隆點(diǎn)后計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞來篩選陽性細(xì)胞系,再通過體細(xì)胞核移植快速生產(chǎn)了IPO13敲除豬,從而證實(shí)通過微量細(xì)胞鑒定快速生產(chǎn)基因編輯豬的可行性.篩選基因編輯陽性細(xì)胞系的一般方法大約需要33.7 d,新建立的方法細(xì)胞篩選周期僅為18.9 d(減少15d),獲得陽性細(xì)胞系的成功率也提高了約4倍.[結(jié)論]本研究建立了一種通過微量細(xì)胞鑒定快速生產(chǎn)基因編輯克隆豬的方法,該方法可行可靠.

摘要： 同一來源的供體細(xì)胞之間存在異質(zhì)性.許多研究已經(jīng)表明體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)效率與供體細(xì)胞有關(guān).然而,鮮有在單細(xì)胞水平分析供體細(xì)胞異質(zhì)性對核移植效率的潛在影響.本研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對同一來源且隨機(jī)挑選的52個(gè)豬耳組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行測序分析.結(jié)果表明有48個(gè)單細(xì)胞的基因表達(dá)模式相似,4個(gè)單細(xì)胞(編號(hào)為D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2)的基因表達(dá)模式與其他單細(xì)胞存在較大的差異,并且不存在基因表達(dá)模式完全相同的兩個(gè)單細(xì)胞.以基因表達(dá)模式相似的48個(gè)單細(xì)胞作為對照,進(jìn)一步分析了單細(xì)胞D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2的差異基因表達(dá)模式:首先利用R語言篩選4個(gè)單細(xì)胞的差異表達(dá)基因,并對前50差異表達(dá)基因進(jìn)行匯總;然后對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析.富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因的主要分子功能包括能量代謝、蛋白質(zhì)代謝和細(xì)胞對刺激的反應(yīng)等;主要通路包括KEGG中富集的與細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、DNA復(fù)制相關(guān)的通路.根據(jù)以上研究結(jié)果并結(jié)合SCNT研究進(jìn)展討論了4個(gè)單細(xì)胞的差異基因表達(dá)模式對核移植胚胎發(fā)育效率的潛在影響.本研究揭示了豬耳組織成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性,并提供了分析精英供體細(xì)胞的一種有效方法,為提高克隆效率帶來新的思路.

摘要： 克隆又稱體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT),是一種將已分化的細(xì)胞重編程恢復(fù)全能性而生產(chǎn)與供體細(xì)胞基因型完全相同后代的無性繁殖技術(shù).豬的克隆技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值,包括擴(kuò)繁優(yōu)良種豬、制備基因修飾豬、保護(hù)珍貴和瀕危豬種以及研究豬體細(xì)胞重編程機(jī)制.然而,克隆豬存在出生率和初生重低以及死胎率、新生期死亡率和畸形率高等問題,這些都嚴(yán)重影響了克隆豬的應(yīng)用前景.供體核的表觀重編程錯(cuò)誤被認(rèn)為是克隆效率低和胚胎發(fā)育異常的主要原因,但是目前大多數(shù)研究通過修正表觀重編程錯(cuò)誤并沒有大幅度提高克隆豬的出生率和健康率.本文綜述了克隆豬的異常表型、發(fā)育異常的原因以及提高豬克隆效率的有效方法,以期為提高克隆豬的成活率提供參考.

摘要： 體細(xì)胞核移植技術(shù)目前發(fā)展尚不成熟,克隆成功率較低.本試驗(yàn)旨在優(yōu)化轉(zhuǎn)脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(A-FABP)體細(xì)胞核移植的技術(shù)體系,為克隆胚胎的生產(chǎn)、移植、并最終繁殖轉(zhuǎn)A-FABP基因克隆牛奠定試驗(yàn)基礎(chǔ).試驗(yàn)系統(tǒng)研究了電融合參數(shù)、以及不同形態(tài)、大小和代數(shù)的供體細(xì)胞對牛胚胎克隆效果的影響,并比較了新鮮囊胚胎和冷凍囊胚胎的移植效率.結(jié)果表明,場強(qiáng)2.5kV/cm、2次電脈沖、脈沖時(shí)間為10μs的電融合參數(shù),和圓形光滑型、直徑為15—25μm、4-6代的轉(zhuǎn)A-FABP基因供體細(xì)胞更適合克隆牛胚胎發(fā)育.

摘要： 動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)對于優(yōu)良種畜的復(fù)制、動(dòng)物遺傳多樣性保存及瀕危動(dòng)物挽救、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)以及人類疾病的治療都具有重要的意義;近幾年豬體細(xì)胞核移植研究取得了一定的進(jìn)展,但總體看來核移植效率還很低,還需要對一些關(guān)鍵技術(shù)的深入研究和不斷完善核移植操作程序,通過對豬體細(xì)胞核移植的關(guān)鍵技術(shù)及影響因素進(jìn)行探討與分析,以其加快豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究,提高豬體細(xì)胞核移植的效率,進(jìn)一步促進(jìn)豬體細(xì)胞核移植技術(shù)在生產(chǎn)中應(yīng)用.

摘要： 目的：為優(yōu)化小型豬體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)技術(shù),探討供體細(xì)胞不同類型、不同傳代數(shù)以及蚜腸霉素(APC)處理各供體細(xì)胞對重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響.方法：小型豬輸卵管上皮細(xì)胞(OEC),耳成纖維細(xì)胞(EFC)和卵丘細(xì)胞(CC)分別經(jīng)血清饑餓或血饑餓后再使用0.1μg/mlAPC處理.核移植重構(gòu)胚體外培養(yǎng)7d,以檢測其發(fā)育能力.結(jié)果：OEC經(jīng)APC處理后,重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚形成均顯著高于僅血清饑餓處理組(61.82％vs56.25％,24.55％vs17.86％;P＜0.05).以EFC為供體細(xì)胞,APC組重構(gòu)胚卵裂率顯著高于血清饑餓組(63.36％vs57.01％;P＜0.05).注入CC,APC處理能顯著提高重構(gòu)胚的囊胚形成率(29.63％;P＜0.05).三種細(xì)胞經(jīng)APC處理,CC作為核供體,重構(gòu)胚的卵裂率和囊胚形成率最高.三種細(xì)胞中,無論哪一種作為核供體,其傳代數(shù)對重構(gòu)胚的發(fā)育沒有影響.結(jié)論：以CC為供體細(xì)胞,血清饑餓后再使用APC處理,更適合小型豬的體細(xì)胞核移植。

摘要： MPF是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一個(gè)非常重要的蛋白激酶,在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)、GVBD發(fā)生、紡錘體形成、MⅡ期停滯的維持等方面均發(fā)揮重要作用.MPF的活性受Wee1、Myt1的調(diào)控.咖啡因是一種蛋白磷酸酶抑制劑,它能抑制Wee1和Myt1的活性,從而抑制有活性的MPF向其無活性的前體轉(zhuǎn)化,進(jìn)而提高M(jìn)PF活性.本試驗(yàn)通過在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)不同階段分別添加不同濃度的咖啡因,以維持受體胞質(zhì)中MPF的高活性,結(jié)果表明:在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)12h時(shí)添加濃度為lmM的咖啡因?qū)β涯讣?xì)胞的成熟沒有顯著影響,但可以顯著提高體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率.

摘要： 本研究通過對比確定了放線菌酮在豬卵母細(xì)胞孤雌激活和體細(xì)胞核移植中的作用.實(shí)驗(yàn)一,對比了體外成熟的豬卵母細(xì)胞經(jīng)電激活結(jié)合6-二甲氨基嘌呤或細(xì)胞松弛素B或放線菌酮處理對孤雌胚胎發(fā)育的影響;實(shí)驗(yàn)二,研究了放線菌酮預(yù)處理卵母細(xì)胞后再經(jīng)電激活和藥物激活對豬孤雌胚胎發(fā)育的影響.實(shí)驗(yàn)三,對比了不同激活藥物對體細(xì)胞核移植的重構(gòu)胚的發(fā)育能力的影響.結(jié)果表明,在孤雌激活過程中,放線菌酮激活能力較其它兩種藥物差,表現(xiàn)為較長的激活時(shí)間和較低的卵裂率及囊胚率.孤雌激活前經(jīng)放線菌酮預(yù)處理可以提高豬孤雌激活胚胎的發(fā)育能力.放線菌酮處理可以提高體細(xì)胞核移植的重構(gòu)胚發(fā)育為囊胚的能力.

摘要： 2005年韓國科學(xué)家報(bào)道首例體細(xì)胞克隆犬出生,隨后體細(xì)胞克隆技術(shù)在寵物犬及工作犬的克隆領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用.由于犬胚胎質(zhì)量較差、發(fā)育能力較低、生殖結(jié)構(gòu)特殊及卵母細(xì)胞在輸卵管內(nèi)成熟的特點(diǎn),因此目前全世界只有韓國科學(xué)家可以獨(dú)立完成體細(xì)胞克隆犬的制備.本研究通過不斷探索,建立了一套具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、穩(wěn)定且高效的犬體細(xì)胞克隆技術(shù)體系.以體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體,實(shí)驗(yàn)用比格犬皮膚成纖維細(xì)胞為核供體,進(jìn)行體細(xì)胞核移植,共移植44枚胚胎至4只代孕母犬體內(nèi),最終獲得3只健康存活的體細(xì)胞克隆比格犬,使我國成為繼韓國之后,世界第二個(gè)掌握犬體細(xì)胞克隆技術(shù)的國家,為該技術(shù)在寵物犬克隆、工作犬復(fù)制及醫(yī)學(xué)模型創(chuàng)建中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ).

摘要： 較小鼠等嚙齒類動(dòng)物而言,猴和小型豬等大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在親緣關(guān)系上與人類更為接近,在解剖、生理生化代謝及疾病發(fā)病機(jī)制等多方面與人類更接近,使它們在復(fù)制人類疾病模型,研究疾病發(fā)病機(jī)制和新藥研發(fā)等中有無可替代的應(yīng)用.而制備遺傳工程大動(dòng)物可以更深入地解析人類疾病,并可為器官移植和新藥研發(fā)提供更充分的實(shí)驗(yàn)材料.基于慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法近幾年已越來越多地被用來制備遺傳工程猴和小型豬.與傳統(tǒng)的原核顯微注射方法和體細(xì)胞核移植法相比,慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因效率高,操作更簡單.因此,構(gòu)筑基于慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法制備遺傳工程猴和小型豬的技術(shù)平臺(tái)將對生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用.

摘要： 本文以綿羊?yàn)檠芯繉ο螅们衅史ǐ@得卵母細(xì)胞，收集卵丘細(xì)胞一卵母細(xì)胞復(fù)合體，進(jìn)行成熟培養(yǎng)。COCs體外成熟19h后，去除周圍卵丘細(xì)胞并將其離心洗滌，培養(yǎng)2代后用含有不同濃度Scriptaid的培養(yǎng)液進(jìn)行接觸抑制處理，然后用0.25%胰蛋白酶消化處理2-3min，用移液槍吹打成單個(gè)細(xì)胞。將卵母細(xì)胞在顯微操作儀下去除第一機(jī)體及周圍的少量胞質(zhì)，并注入卵丘細(xì)胞，進(jìn)行融合。隨后置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)3h后觀察融合結(jié)果，再對融合后的胚胎進(jìn)行激活。將胚胎在含有不同濃度Scriptaid的發(fā)育液中培養(yǎng)。然后對不同時(shí)期的胚胎進(jìn)行免疫染色。研究表明：采用0.21μmo1/L的Scriptaid分別處理綿羊卵丘細(xì)胞和核移植胚胎后能提高胚胎體外發(fā)育能力;但采用0.2μmo1/L Scriptaid同時(shí)處理綿羊卵丘細(xì)胞及胚胎時(shí)所得胚胎體外發(fā)育能力低于單獨(dú)處理供體卵丘細(xì)胞或胚胎時(shí)的效果;添加Scriptaid可顯著提高綿羊核移植胚胎1一細(xì)胞、2一細(xì)胞、4一細(xì)胞和8一細(xì)胞期H4K12乙酞化水平。

摘要： 本實(shí)驗(yàn)以豬體外成熟卵母細(xì)胞為材料，檢測豬卵母細(xì)胞質(zhì)中核質(zhì)蛋白的定性定量表達(dá)，同時(shí)檢測其編碼基因Npm基因的表達(dá)量，為今后體細(xì)胞核移植過程中核重新編程研究提供理論依據(jù)。

摘要： 本實(shí)驗(yàn)首次構(gòu)建pCX-mRFP1-pgk—neoR基因，生產(chǎn)表達(dá)紅色熒光蛋白的小型豬，為以后基因敲除的研究提供理想動(dòng)物模型。

摘要： 本發(fā)明公開了一種基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建的牛體細(xì)胞克隆胚的處理方法，將待移植的牛體細(xì)胞注入到去核后的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合，在電融合之后1h，挑選成功融合的牛體細(xì)胞克隆胚用1μM的Oxamflatin處理牛體細(xì)胞克隆胚胎12h，可以顯著提高牛體細(xì)胞克隆囊胚的發(fā)育率和質(zhì)量，可高效體外生產(chǎn)牛體細(xì)胞克隆胚胎。

摘要： 一種基于微流道的機(jī)器人化體細(xì)胞核移植操作方法。該方法的特點(diǎn)是引入的微流道用于存儲(chǔ)細(xì)胞，引入了平行的雙針分別用于細(xì)胞去核以及注核。該方法包括以下關(guān)鍵步驟：細(xì)胞的微流道存儲(chǔ)，細(xì)胞的定位，細(xì)胞吸持，細(xì)胞去核，去核針與注核針的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞注核，最后釋放已操作的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該流程較傳統(tǒng)體細(xì)胞核移植流程節(jié)約了41.7％的時(shí)間，并與手動(dòng)體細(xì)胞核移植的存活率、成功率一致，有效的提升了體細(xì)胞核移植的效率與可重復(fù)性。

摘要： 本發(fā)明公開了一種提高豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效率的方法。本發(fā)明提供了毛殼素的應(yīng)用，為如下(a1)?(a5)中的至少一種：(a1)制備用于動(dòng)物體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞培養(yǎng)液；(a2)制備用于動(dòng)物體細(xì)胞核移植的重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液；(a3)培養(yǎng)用于動(dòng)物體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞；(a4)培養(yǎng)用于動(dòng)物體細(xì)胞核移植的重構(gòu)胚胎；(a5)促進(jìn)動(dòng)物體細(xì)胞核移植中的重構(gòu)胚形成囊胚。本發(fā)明通過利用小分子藥物毛殼素對體細(xì)胞核移植中的供核細(xì)胞或者重構(gòu)胚胎進(jìn)行處理，促進(jìn)體細(xì)胞核移植重編程的發(fā)生，顯著提高克隆胚胎的囊胚發(fā)育率和囊胚細(xì)胞數(shù)，最終提高豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的整體效率。本發(fā)明對提高豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的整體效率有重要意義。

摘要： 本發(fā)明公開了一種基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建的牛體細(xì)胞克隆胚的處理方法，將待移植的牛體細(xì)胞注入到去核后的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合，在電融合之后1h，挑選成功融合的牛體細(xì)胞克隆胚用1μM的Oxamflatin處理牛體細(xì)胞克隆胚胎12h，可以顯著提高牛體細(xì)胞克隆囊胚的發(fā)育率和質(zhì)量，可高效體外生產(chǎn)牛體細(xì)胞克隆胚胎。

摘要： 用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備移核胚胎干細(xì)胞的方法是關(guān)于應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備細(xì)胞的一種方法，該方法用顯微操作儀將成年動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞核移植入動(dòng)物胚胎的去核胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)體內(nèi)，重新組成具全新基因型移核胚胎干細(xì)胞，并培養(yǎng)移核胚胎干細(xì)胞使其分裂、增殖到2

摘要： 本發(fā)明涉及一種杜鵑素促進(jìn)體細(xì)胞核移植效率的應(yīng)用及方法。本發(fā)明中，杜鵑素用于制備提高體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育率和出生率的藥物的應(yīng)用，與當(dāng)前多種小分子化合物在促進(jìn)的體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效率方式相比，本發(fā)明涉及的原理與以往通過調(diào)控體細(xì)胞核移植過程中表觀遺傳學(xué)差異的方法不同，小分子化合物杜鵑素能夠有效促進(jìn)體細(xì)胞核移植胚胎的基因組穩(wěn)定性，并顯著提高胚胎發(fā)育率和出生率，因而存在與其他藥物聯(lián)用達(dá)到更好效果的可能性。同時(shí)本發(fā)明所建立的篩選流程也更為有效，為探究小分子化合物靶點(diǎn)提供了合理的篩選方式。

摘要： 本發(fā)明涉及一種體細(xì)胞核移植方法及其應(yīng)用。該方法利用單倍體胚胎干細(xì)胞體系獲得單等位基因同時(shí)敲除26個(gè)H3K27me3相關(guān)的印記基因中的一個(gè)或多個(gè)的供體體細(xì)胞進(jìn)行核移植。結(jié)果顯示，單等位敲除Slc38a2、Slc38a4、Sfmbt2、Etv6、Platr4、Gramd1b、Slc38a1、Gab1、Mbnl2、Smoc1、Bmp7、Rbms1、Fam198b、Sh3gl3、Hunk、Jade1、E2f3、Tle3、Runx1、Epas1、Bbx、Enc1、Inhbb、Sox21、Otx2、Rbp2中的一個(gè)或多個(gè)(如Sfmbt2、Jade1、Gab1和Smoc1這四個(gè)中的一個(gè)或多個(gè))H3K27me3的印記基因使得這些基因的印記表達(dá)模式趨于正常。同時(shí)，利用該供體體細(xì)胞進(jìn)行克隆可以將體細(xì)胞克隆效率提升至14％，而野生型的對照組體細(xì)胞克隆效率為0。另外，該方法獲得的克隆動(dòng)物，大胎盤?大胎兒現(xiàn)象得到了修正。

摘要： 一種基于微流道的機(jī)器人化體細(xì)胞核移植操作方法。該方法的特點(diǎn)是引入的微流道用于存儲(chǔ)細(xì)胞，引入了平行的雙針分別用于細(xì)胞去核以及注核。該方法包括以下關(guān)鍵步驟：細(xì)胞的微流道存儲(chǔ)，細(xì)胞的定位，細(xì)胞吸持，細(xì)胞去核，去核針與注核針的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞注核，最后釋放已操作的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該流程較傳統(tǒng)體細(xì)胞核移植流程節(jié)約了41.7％的時(shí)間，并與手動(dòng)體細(xì)胞核移植的存活率、成功率一致，有效的提升了體細(xì)胞核移植的效率與可重復(fù)性。

摘要： 本申請揭示，通過將體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNT細(xì)胞)注射入非人類第一哺乳動(dòng)物的成熟囊胚中，從而補(bǔ)足導(dǎo)致該非人類第一哺乳動(dòng)物的該目標(biāo)器官發(fā)育的缺失，因此可再生如腎臟的目標(biāo)器官。本申請還揭示，使用SCNT細(xì)胞在具有與發(fā)育期中目標(biāo)器官發(fā)育缺失相關(guān)的畸形的非人類第一哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)生產(chǎn)目標(biāo)器官的方法，其中所生產(chǎn)的目標(biāo)器官源自第二哺乳動(dòng)物，且該第二哺乳動(dòng)物是不同于該非人類第一哺乳動(dòng)物的個(gè)體。

摘要： 本實(shí)用新型公開了一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚融合裝置，包括融合皿、兩個(gè)電極槽和若干個(gè)微穴；若干個(gè)微穴為設(shè)于融合皿底面的盲孔，盲孔內(nèi)容納有重構(gòu)胚，并且微穴的直徑略小于重構(gòu)胚的直徑；若干個(gè)微穴為兩行排列設(shè)置，各行的微穴依次間隔排列，微穴可以固定和排列重構(gòu)胚，且已調(diào)整好方向和位置的重構(gòu)胚不會(huì)由于調(diào)整其它重構(gòu)胚方向的細(xì)小動(dòng)作而發(fā)生方向的偏移，且一次可以操作20?30個(gè)重構(gòu)胚；融合皿底面上并且位于微穴的兩側(cè)各設(shè)有一第一凹槽，融合皿的相對的兩側(cè)壁各設(shè)有兩第二凹槽，一第一凹槽的兩端各與一第二凹槽連通，進(jìn)而形成一電極槽，電極槽內(nèi)有金屬絲，金屬絲不需要用膠固定，金屬絲直接通過電極槽插入到皿底便可以固定住。