摘要:
【背景】脂肪組織分為皮膚下的皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue,SAT)和腹部?jī)?nèi)器官周圍的內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue,VAT),皮下脂肪作為影響肉類美味與否的重要因素,探究皮下脂肪沉積分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于育種改良和畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。Krüppel-like factors 12 (KLF12)是一個(gè)進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子,可以在多種細(xì)胞類型中表達(dá)并控制著廣泛的細(xì)胞過程?!灸康摹垦芯揩@得山羊KLF12的分子特征并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時(shí)明確KLF12在山羊組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式以及干擾KLF12對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用,為進(jìn)一步研究KLF12在脂肪沉積過程中的潛在作用提供理論依據(jù)?!痉椒ā坷媚孓D(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆山羊KLF12完整編碼序列(coding sequence,CDS)區(qū),使用在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)山羊KLF12核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)KLF12在山羊心臟、肝臟、腹部脂肪、皮下脂肪、臂三頭肌、背最長(zhǎng)肌等14個(gè)組織中的表達(dá)水平,以及誘導(dǎo)分化不同時(shí)間段KLF12在皮下前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。隨后,試驗(yàn)通過化學(xué)合成山羊KLF12小干擾RNA(si-KLF12),使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將山羊si-KLF12序列轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中。使用100μmol·L-1油酸導(dǎo)液誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。利用油紅O以及Bodipy染色方法和qRT-PCR技術(shù)分別從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)的角度闡明干擾KLF12對(duì)皮下前體脂肪細(xì)胞脂滴積聚和脂肪分化標(biāo)志基因mRNA表達(dá)水平的影響?!窘Y(jié)果】試驗(yàn)成功獲得包含開放閱讀框(open reading frame,ORF)(1 209 bp)的山羊KLF12(1 315 bp,編碼402個(gè)氨基酸)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示KLF12主要位于細(xì)胞核,此外,KLF12無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽,且在317—341、347—371及377—399氨基酸處存在3個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZnF;2H2)。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示KLF12在山羊心臟和脾臟的表達(dá)水平極顯著高于其他組織(P<0.01)。此外,在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化過程中KLF12表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化60 h時(shí)達(dá)到峰值。于山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-KLF12后利用油紅O以及Bodipy染色法從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞脂滴聚積明顯增加,同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示,脂肪分化標(biāo)志基因脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,LPL)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)而前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)因子(preadipocyte factor 1,Pref-1)的表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果以及脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)水平變化情況,推測(cè)KLF12在皮下脂肪細(xì)胞分化過程中起到負(fù)調(diào)控作用?!窘Y(jié)論】通過對(duì)山羊KLF12的分子生物學(xué)特征、組織細(xì)胞間的表達(dá)規(guī)律以及對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過程的潛在調(diào)控作用的研究表明,KLF12是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過程中的負(fù)調(diào)控因子,并且這種作用可能是通過調(diào)控LPL、PPARγ和Pref-1實(shí)現(xiàn)的,為進(jìn)一步探究KLF12在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。