摘要:
為獲得增強型貓ω干擾素(FeIFN-ω),本研究通過分子對接方法預(yù)測和參考相關(guān)位點研究,設(shè)計3組定點突變引物。以pJET-FeIFN-ω為模板分別擴增FeIFN-ω基因及其3個突變基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并連接慢病毒載體pLVX-IRSE,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、p LVX-FeIFN-ω-T188R。4個重組質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒psPAX2和膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝慢病毒,48 h后收獲細胞上清即為慢病毒。分別將4個慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)293懸浮細胞(293s),擴大培養(yǎng)后收獲細胞上清,經(jīng)鎳離子親和層析柱純化蛋白,并經(jīng)SDS-PAGE檢測、BCA法測蛋白濃度。結(jié)果顯示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s細胞中得到高效表達,且蛋白純化效果好;經(jīng)BCA法測濃度,4種重組蛋白濃度均約為200μg/mL,即獲得了重組干擾素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。4種重組干擾素分別經(jīng)貓腎細胞(CRFK)孵育18 h后接種貓杯狀病毒(FCV)或貓皰疹病毒(FHV)12 h,經(jīng)相對熒光定量PCR法檢測干擾素抗FCV和FHV活性;4種重組干擾素分別經(jīng)CRFK細胞孵育12 h,經(jīng)相對熒光定量PCR法檢測干擾素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示:實驗組與空白對照組差異極顯著(P0.05)或表現(xiàn)為活性降低,rFeIFN-ω-T188R與rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R差異均顯著(P<0.05)表現(xiàn)為活性增強,并且r FeIFN-ω-T188R抗病毒活性及誘導(dǎo)ISGs的轉(zhuǎn)錄水平均比rFeIFN-ω高1倍左右。選擇r FeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R分別與His純化樹脂結(jié)合,加入等量表達干擾素受體(IFNAR1/R2)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞的裂解液,4°C結(jié)合過夜,經(jīng)western blot鑒定干擾素與IFNAR1/R2結(jié)合親和力分析,結(jié)果顯示,rFeIFN-ω-T188R與IFNAR1的結(jié)合能力比r FeIFN-ω高1倍左右,且兩者與IFNAR2的結(jié)合能力差異不顯著。本研究成功篩選到增強型rFeIFN-ω-T188R,為研究高效FeIFN-ω藥物奠定了基礎(chǔ)。